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说明书下载产品包装：
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产品编号 |
产品名称 |
包装 |
保存温度 |
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DW2047-A |
TdT酶 |
100ul |
-20℃ |
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DW2047-B |
FITC-标记反应混合物 |
1.25 mL×2 |
避光、-20℃ |
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DW2047-C |
PI染色液 |
1.25 mL×2 |
-20℃ |
保存条件：
冰袋运输。本试剂盒储存在-20℃，FITC-标记反应混合物避光储存于-20℃。
操作流程：
一、石蜡包埋组织切片处理流程
A.样本的脱蜡处理
1、室温下将石蜡组织切片放入二甲苯中浸泡5分钟。更换新的二甲苯再重复1次。
2、室温下用100%乙醇浸泡切片5分钟,更换新的100%乙醇再重复1次。
3、室温下用梯度乙醇(90、80、70%)各浸洗1次,每次2分钟,逐渐增加水分。
4、用PBS 轻轻润洗切片,并用滤纸小心吸干样本周围多余的液体。这时可用石蜡笔或疏水笔在样品周围描绘样品分布的轮廓,便于下游透性处理和平衡标记操作。
注意：在实验过程中，切勿让样品干燥。
B.增加样本的通透性
1、用PBS溶液配置终浓度为20ug/m1的蛋白酶K(不含DNaso活性),每个样本需要100uL蛋白酶K溶液。
2、每个样本上滴加100μL浓度为20ug/m1的蛋白酶K溶液,使其被全部覆盖,室温孵育20分钟。
注意,严格控制孵育时间,孵育时间过长可对细胞造成一定的伤害,过短则可能造成透性处理不充分,形响标记效率。蛋白酶K工作波的使用浓度、处理时间及温度因组织或细胞
温度因组织或细胞的类型或固定方法的不同而有所不同,使用者可参照试/盒提供的标准使用说明摸索凝合适的实验条件。
3、用PBS溶液润洗样本3次。
4、轻轻去掉多余液体,并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润。
C.配制标记反应液:
| 组分比例 | 1个样品 | 10个样品 | 20个样品 |
| TdT酶 | 2ul | 20ul | 40ul |
| FITC-标记反应混合物 | 48ul | 480ul | 960ul |
| 标记反应液 | 50ul | 500ul | 1000ul |
D.标记反应
1、洗涤样品一次,轻轻吸干样本周围的缓冲液,注意不要触碰到样本。
2、在每个样本上立即滴加50μ1上述准备的TdT标记反应混合物。
3、用预先裁剪好的比样本稍大的封口膜覆盖样本。
4、避光,将切片置于湿盒中于37℃孵育60-90分钟。
E.终止与结果判断
1、移走封口膜,并将切片置于PBS溶液中室温孵育1分钟。
2、轻轻去掉多余液体,换用新鲜的PBS溶液室温孵育1分钟。
3、用滤纸轻轻擦掉样本周围及背面的PBS溶液。
注意:为了降低背景,载玻片在用PBS洗一遍之后,可再用含0.1% Triton@ X-100和2mg/ml BSA的PBS洗3次,毎次5分钟,这样游离的未反应的标记物可以清除较干净。
4、滴加50uL PI染色液,在黑暗中室温放置5分钟
5、洗涤样本,将载玻片浸入去离子水中,室温放置5分钟。重复两次,总共洗三次。
6、滴干载玻片上多余的水并且用吸水纸擦拭细胞周边的区域。
7、立即在荧光显微镜下分析样本,用标准的荧光过滤装置在520±20nm的荧光下观察绿色荧光,
在>600nm下观察PI的红色荧光。如有必要,载玻片能在4℃黑暗条件下存放过夜。
注意,P1能将调亡和未凋亡的细胞都染成红色,只在调亡的细胞核中才有FITC-duTP掺入而定位的绿色荧光。
8、统计凋亡细胞数和细胞总数并计算出细胞凋亡率。
二 组织冰冻切片处理流程
该操作流程与石蜡包埋组织切片相似，除了将脱蜡步骤替换为固定和短暂的水化步骤，并将蛋白酶K的处理时间缩短到10分钟。在进行该实验检测前需固定冰冻组织。为了避免在清洗步骤中的样本在玻片上损失，建议不用洗瓶清洗，而是将玻片浸在PBS溶液中2-3次进行清洗。
注意：在操作中避免样本干燥。
A.组织固定与水化
1、将玻片浸没在4％多聚甲醛溶液（溶于PBS）中，室温孵育15分钟。
2、轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。
3、将玻片浸没在PBS 溶液中，室温孵育15分钟。
4、轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。这时可用疏水笔在样品周围描绘样品分布的轮廓，便于下游透性处理和平衡标记操作。
B．增加样本通透性并将蛋白酶K的处理时间缩短到10分钟，其他同于（一、B）
C.D.E.同于一
三、固定细胞片处理流程
该操作流程与冰冻组织切片相似，除了将蛋白酶K的处理时间缩短到5分钟。将悬浮细胞固定到玻片上的操作请参考“注意事项”章节。为了避免在清洗步骤中的样本在玻片上损失，建议不用洗瓶清洗，而是将玻片浸在PBS溶液中2-3次进行清洗。注意：在操作中避免样本干燥。
四、流式细胞术检测细胞悬液处理流程
A.细胞固定
1、4°C缓慢离心（2000rpm）5分钟，去除培养上清，PBS洗涤一次，重新离心收集细胞。
2、用新鲜配置4％多聚甲醛（in PBS）固定细胞，使其终密度为1x106／ml，室温孵育10分钟。为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动的同时进行固定，离心收集细胞。按照上述方法PBS重悬洗涤一次，去除固定液并用80％乙醇溶液以相同细胞密度重悬。
注意：固定后的细胞可以保存在4°C，可以稳定保存2-6个月。
B.水化
1、将1ml 固定细胞（1x106 cells／ml）转移到干净的离心管中。
2、室温缓慢离心（1000rpm）5分钟，去除乙醇溶液上清。
3、将细胞重悬在200μl PBS 溶液中。
4、室温缓慢离心（1000rpm）5分钟，去除PBS溶液，重复一次。
C.增加细胞通透性
用含0.1％ Triton X-100和0.2％BSA的PBS重悬细胞，室温孵育5-10分钟。
D1．设立阳性对照（可选）
1、DNase I溶液配置：3000U／ml或者1mg／ml in PBS， 1mM MgS04 and 1mg／ml BSA
2、取经过预处理（已完成固定和通透性处理）的细胞，用DNaseI处理，室温孵育10分钟。
D2．设立阴性对照（可选）
在配置E中的标记反应液时，不加TdT酶。
E.配制标记反应液：
| 组分比例 | 阴性对照 | 1个样品 | 10个样品 | 20个样品 |
| TdT酶 | 0 | 2ul | 20ul | 40ul |
| FITC-标记反应混合物 | 48ul | 48ul | 480ul | 960ul |
| 标记反应液 | 加水至50ul | 50ul | 500ul | 1000ul |
F.标记反应
1、PBS洗涤样品一次。
2、在每个样本加入50μ1上述准备的TdT 标记反应混合物，重悬样品。
3、避光，将样品放置于37℃孵育60分钟。
G.终止与结果评断
1、反应完成后，用200uLPBS洗涤1次。
2、滴加50uL PI染色液，在黑暗中室温放置5分钟。
3、离心，用200uLPBS洗涤样本，总共洗三次。
4、立即用流式细胞仪分析样本。
注意：PI能将凋亡和未凋亡的细胞都染成红色，只在凋亡的细胞核中才有FITC-dUTP掺入而定位的绿色荧光。
5、统计凋亡细胞数和细胞总数并计算出细胞凋亡率。
流式细胞仪检测：
用装备有488nm氩离子激发光源的流式细胞仪检测标记后的细胞悬液，发射波长是517nm（FITC）和580（PI）。可以设定FITC-PI双染的细胞和PI单染的细胞比值作为凋亡细胞的比率。
·流式细胞仪检测中光散射参数的改变同样可以用来监测和判断细胞凋亡情况的发生。例如，未处理的悬浮细胞大多有很高的前向散射值，但诱导出现凋亡后，由于细胞皱缩和膜起泡，侧向散射将大大增强。结合光散射参数的改变及TUNEL 标记实验的检测结果，往往可以确定或互相印证用单个方法得到的结论。
常见问题:
1．非特异性荧光
a.有些细胞或组织，核酸或者聚合酶活性水平较高，导致出现非特异性的荧光标记。建议：取细胞或组织后立即固定，以阻止这些酶导致假阳性。
b.TUNEL反应时间过长，或细胞或组织表面不能保持湿润，也可能出现非特异性荧光。建议：注意控制反应时间，并确保样品湿润。
2．荧光背景很高
a.支原体污染。建议：请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染。
b．高速分裂和增殖的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA断裂，产生较多3＇-OH末端。建议：凋亡晚期检测，同时减少TUNEL反应时间，以提高信噪比。
c.TUNEL反应过强。建议：减少TdT的用量至标准量的20-50％。
3．标记效率低
a.样品固定时间过长，导致交联程度过高。建议：适当减少固定时间。
b．荧光淬灭。Fluorescence在普通光照10分钟就会严重淬灭。建议：避光操作。
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