IP实验部分

实验步骤：

步骤 1：细胞用 PBS 清洗后，在离心管中加入 200μL 溶液 1，10μL 0.1 M PMSF，冰上裂解

10 min，涡旋震荡，12000g，离心 5 min，取上清。测定蛋白浓度，取 500μg 蛋白到新的

1.5mL EP 管中，用溶液 1 补足体积到 200μL。

步骤 2：加入 2μL 溶液 2，2μL 0.1 M PMSF，冰上孵育 30min。

步骤 3：加入预冷的 800μL 甲醇，350μL 氯仿，600μL ddH2O，上下颠倒混匀，6000 rpm，

4℃，离心 10 min，此时可见溶液中间有一层清晰可见的乳白色蛋白膜，去除膜上下层液体，

沉淀加入 800μL 甲醇，6000 rpm，4℃，离心 5 min，去除上清，风干 2-3min 以去除多余甲醇。

步骤 5：沉淀加入 200μL 溶液 1 吹打后震荡混匀 2-3min,重复一次步骤 3，沉淀加入 200μL 溶液 1 吹打后震荡混匀 2-3min。

步骤 6: 加入 2μL 溶液 2，2μL 0.1 M PMSF，冰上孵育 30min。

步骤 7：加入 50μL 溶液 5，2μL 0.1 M PMSF，冰上孵育 30min。

步骤 8: 重复一次步骤 3，沉淀加入 100μL 溶液 1 吹打后震荡混匀 2-3min，测定蛋白浓度，

备用。

步骤 9：取 60μL 溶液 6（使用前混匀）至新的 1.5mL EP 管中，使用 PBS 清洗 3 次，每次

清洗后 2000g 离心 30s，去除上清。

步骤 10：将步骤 8 中的蛋白溶液与步骤 9 清洗好的珠子混合，4℃温和旋转孵育 4h/过夜。

步骤 11：孵育结束后，2000g 离心 30s，弃上清，收集珠子，使用 PBS 清洗 3 次，每次清

洗后 2000g 离心 30s，去除上清。

步骤 12：加入 50μL loading buffer 煮沸 10-15min，离心取上清，重复洗脱一次，合并两次

洗脱液溶液用于后续 WB 实验。

 

WB检测实验-用TPI1抗体检测

步骤 1：将蛋白液进行 SDS-PAGE 胶分离，并将蛋白转到 PVDF 膜上。

步骤 2：用 1XTBS-T（或者实验室常用洗膜溶剂） 清洗膜 2 次，每次 10 min。

步骤 3：用 1XTBS-T 配制工作浓度 3% BSA，室温封闭 PVDF 膜 1h。

步骤 4：用 1XTBS-T 清洗 PVDF 膜 10min。

步骤 5：用 1XTBS-T 配制工作浓度 3% BSA，加入常用内参一抗(稀释比例 按照说明书)，4℃

孵膜过夜

步骤 6：用 1XTBS-T 清洗 PVDF 膜 3 次，每次 10min。

步骤 7：用 1XTBS-T 配制工作浓度 3% BSA，加入二抗(稀释比例 按照说明书)，室温，1h。

步骤 8：用 1XTBS-T 清洗 PVDF 膜 3 次，每次 10min。

步骤 9：用化学发光仪曝光检测。