ChIP实验步骤 实验原理： 通过甲醛交联固定蛋白质-DNA复合物，超声破碎染色质，利用特异性抗体富集目标蛋白结合的DNA片段，最终分析DNA序列或含量。 主要试剂与材料 37% 甲醛（交联用） 甘氨酸（终止交联） 细胞裂解液（含蛋白酶抑制剂） 超声破碎仪（或超声探头） 特异性抗体（目标蛋白抗体及对照IgG） Protein A/G磁珠（或琼脂糖珠） DNA纯化试剂盒 其他：SDS裂解液、低盐/高盐洗涤缓冲液、LiCl洗涤液、TE缓冲液等。 实验流程 1. 细胞固定与交联 适用样本：贴壁细胞、悬浮细胞或组织。 步骤： 向培养基中加入甲醛至终浓度 1%，室温交联 10-15分钟（时间需优化，过长导致染色质难破碎）。 加入甘氨酸至终浓度 0.125M，室温孵育 5分钟 终止交联。 冰预冷PBS洗涤细胞2次，收集细胞（离心或刮取）。 2. 染色质片段化 关键：超声将染色质打断至 200-1000 bp 片段（需预实验优化）。 步骤： 重悬细胞于含蛋白酶抑制剂的裂解液中，冰上裂解 10分钟。 超声处理（示例参数）： 功率：20-30% 最大功率（避免过热） 时间：10秒开/30秒关，循环 10-15次（根据仪器调整） 取少量超声后染色质，电泳验证片段大小（目标：200-500 bp）。 3. 免疫沉淀（IP） 预清除（可选）： 加入Protein A/G磁珠，4℃旋转孵育 1小时，减少非特异性结合。 抗体孵育： 分装染色质至各管，加入 特异性抗体（实验组）或 对照IgG（阴性对照）。 4℃旋转孵育 过夜（或根据抗体说明调整时间）。 捕获复合物： 加入Protein A/G磁珠，4℃旋转孵育 2-4小时。 4. 洗涤与洗脱 洗涤步骤（依次进行，保持低温）： 低盐缓冲液 → 高盐缓冲液 → LiCl缓冲液 → TE缓冲液，各洗1次。 洗脱DNA-蛋白复合物： 加入含1% SDS的洗脱缓冲液，65℃震荡孵育 15分钟，重复一次。 解交联： 加入5M NaCl至终浓度 0.2M，65℃孵育 4-6小时（或过夜）。 5. DNA纯化与检测 纯化DNA： 使用DNA纯化试剂盒（如酚-氯仿抽提或硅胶柱纯化）。 检测： qPCR：定量目标DNA富集程度（需设计特异性引物）。 测序（ChIP-seq）：用于全基因组分析。 注意事项 抗体选择：需验证抗体ChIP级别特异性（避免假阳性）。 超声优化：过度超声破坏复合物，不足导致片段过大。 对照设置： Input DNA（未IP的染色质，作为总DNA对照）。 IgG对照（排除非特异性结合）。 防止降解：全程使用蛋白酶抑制剂，操作快速且低温。 常见问题与解决 问题 可能原因 解决方案 信号弱或无信号 抗体效率低/超声过度 验证抗体活性，优化超声条件 高背景（假阳性） 非特异性结合或洗涤不彻底 增加洗涤次数，优化抗体浓度 DNA片段过大/过小 超声参数未优化 预实验调整超声功率和时间 Input DNA量低 细胞起始量不足或裂解不完全 增加细胞量，确保充分裂解 安全提示 甲醛、SDS等试剂具有毒性，需在通风橱中操作，佩戴手套、护目镜。 超声仪避免空载运行，防止探头损坏。