产品介绍：

      染色质免疫共沉淀（ChIP）试剂盒，包含足够完成 20个反应的试剂。

试剂盒组分：

产品编号	产品名称	包装	保存温度
DW1151-A	Cell lysis buffer	25ml	4℃，一年
DW1151-B	Low salt wash buffer	80ml	4℃，一年
DW1151-C	High salt wash buffer	25ml	4℃，一年
DW1151-D	Protein A/G磁珠	1ml	4℃，一年
DW1151-E	LiCl wash buffer	25ml	4℃，一年
DW1151-F	Elution buffer	1ml	4℃，一年
DW1151-G	5 M NaCl	500ul	4℃，一年
DW1151-H	Proteinase K	100ul	-20℃，一年
DW1151-I	RNase  A	100ul	-20℃，一年
DW1151-J	0.1 MTT	200ul	-20℃，一年
DW1151-K	10 x Glycine solution	50ml	4℃，一年

 

自备产品：

甲醛溶液（推荐CST)、蛋白酶抑制剂、 磷酸酶抑制剂、 DNA纯化试剂盒

样品准备：

1. 细胞数量：

建议使用1-5×10⁷个细胞进行ChlP实验。细胞数量过少可能导致DNA浓度不足，影响后续实验。

2. 甲醛交联：

(1)配制1％甲醛溶液：将20 ml无血清培养基与甲醛溶液摇匀，使甲醛的终浓度为1%。

(2)弃去细胞培养基， 用PBS洗涤细胞2次。

(3)加入18ml  1％甲醛溶液，室温孵育2-10分钟。注：交联时间根据实验需求和样本调整，通常

2-10分钟足够。交联时间过长可能导致DNA片段过大，影响后续超声处理。

3.终止交联：

(1)加入2 ml 10 x甘氨酸溶液， 摇匀，室温反应5分钟， 终止交联反应。

(2)弃去上清液，加入10 ml预冷的PBS,洗涤细胞2次，去除残留的甲醛和甘氨酸。

4.细胞收集：

(1)加入 10 ml 预冷的PBS, 用细胞刮将细胞刮下， 并转移至 15 ml 离心管中。

(2)1000 X g, 4度, 离心 5 分钟， 弃去上清液。

细胞裂解：

细胞加入1mL   Cell lysis buffer( DW1151-A )，【注】使用前加入适量蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，充分混匀，冰上反应10分钟。

超声处理：

1.使用超声仪将 DNA 打断成 200 -1000 bp的片段。 【注】超声条件需要根据细胞类型和超声仪型号进行优化。

2.推荐条件：使用 3mm 探头，设置跟大超声功率约 300W，每次超声 20 秒，休息 40秒， 重复 10-20 次。 注意：避免样品过热， 超声过程中不要产生气泡，建议用间接超声仪，在冰里面操作。

3.超声后， 8000 x g, 4度, 离心 10 分钟， 收集上清液， 即获得交联染色质制备物， 可置于－80 C保存。

4.取出 50 µL 已超声的样品检测 DNA 的浓度及片段大小。 【注】可根据 DNA 的片段大小调整超声时间。

 

检测 DNA 浓度及片段大小

1. 取出 50 µL 超声后的样品， 加入 4.8 µL 5 M NaCl （DW1151-G）和 2 µL RNase  A（DW1151-I）  ，65 C反应 2 小时。

2. 加入 2 ul Proteinase K （DW1151-H）, 60度反应 1 小时。

3. 使用 DNA 纯化试剂盒或酚氯仿法纯化 DNA。

4. 将 DNA 稀释 50 倍，检测 0D260 值，计算DNA 浓度(µg/ml = OD260 x 2500)。 理想 DNA 浓度应在 50-200 µg/ml。

5. 使用 1％琼脂糖凝胶电泳分析 DNA 片段大小，确保 DNA片段在 200-1000 bp之间。

 

Chromatin IP

【注】Cell lysis buffer 在使用前已加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。 1. 按照下表配制 Chromatin IP Mix:

1. 按照下表配制 Chromatin IP Mix:

试剂名称	体积 (ul）	终浓度
Cell lysis buffer(DW1151-A )	0- 300	体积为495ul-交联染色质提交体积
0.1 MTT(DW1151-J)	5	1 µM
交联染色质制备物	200- 500
合计	500ul

【注】应设置阴性对照和阳性对照。 同时取出 10 µL交联染色质制备物作为 Input。

 

2. 抗体孵育：

在 Chromatin lP Mix中加入 IP 级抗体， 混匀， 4°c旋转孵育 4 小时以上或过夜。【注】抗体使用通常为 2-5 µg,具体用量参考抗体生产商的推荐。

3. 磁珠处理：

(1)将 Protein A/G Magnetic Beads（DW1151-D） 重悬， 取 50 µL 至新的离心管中。

(2)将离心管置于磁力架上， 收集磁珠并弃掉上清液。

(3)加入 100 µL Cell lysis buffer(DW1151-A ), 重悬磁珠， 置于磁力架上， 收集磁珠并弃掉上清液。

重复洗涤—次。

4.免疫沉淀：

将 Chromati nlPMix加入含有磁珠的离心管中， 4°c旋转孵育 2 小时。

 

4. 洗涤步骤：

(1)将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

(2)加入 1 ml Low Salt Wash Buffer（DW1151-B）, 温和重悬磁珠， 4°c旋转孵育 5 分钟。

(3)重复洗涤 2-3 次。

(4)加入 1 ml High Salt Wash Buffer（DW1151-C），温和重悬磁珠， 4°c旋转孵育 5 分钟。

(5)加入 1 ml LiCI Wash Buffer（DW1151-E），溫和重悬磁珠，置于磁力架上，收集磁珠。

 

6. 洗脱：

(1)加入 100 µL Elution Buffer（DW1151-F）, 涡旋， 65°C孵育 30 分钟。

(2)将离心管置于磁力架上，收集上清液至新的离心管中。

 

 

7. DNA 纯化：

(1)向每个反应（包括 Input)中加入 6 µL    5 M NaCl（DW1151-G） 和 2 µL Proteinase K（DW1151-H）, 65°C反应 2 小时。

(2)使用 DNA 纯化试剂盒或酚氯仿法纯化 DNA.

 

注意事项：

1.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

2.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

 

本产品在文章中的写法：

 

英文： Dowobio （Shanghai，China）

 

中文： 上海多沃生物科技有限公司  Dowobio，上海