产品介绍：

      染色质免疫共沉淀（ChIP）试剂盒，包含足够完成 24 个反应的试剂，每个反应用 40 μL树脂。 由于每次 ChIP 需要设置实验组和对照组， 因此本试剂盒可以完成 12 次 ChIP 实验。

 

试剂盒组分：

 

I  产品简介

染色质免疫共沉淀（ChIP）是研究体内 DNA 与蛋白结合的技术。先用甲醛交联细胞内的“蛋白-DNA”复合物， 裂解细胞后，用超声波破碎 DNA 至适合的长度，采用特异性抗体捕获细胞内的诱饵蛋白及其结合的 DNA 片段，  再加入 protein G 树脂沉淀“抗体-诱饵蛋白-结合 DNA”复合体，随后将蛋白与 DNA 解交联，提取结合的 DNA。 该 DNA 可用于后续的定量 PCR 检测（qPCR）或高通量测序（seq）。

 

II  重要产品信息

• 请勿干燥、冷冻或剧烈涡旋树脂，这些操作会导致树脂聚集而降低结合能力。

• 由于煮沸会导致树脂聚集并且失去结合能力，经煮沸的树脂不应再次使用。

• 本试剂盒采用抗体与抗原双洗脱的方式， 因此在诱饵蛋白的 western-blot 检测结果中，至少存在 3 个条带： 抗 体的重链（50 kDa），抗体的轻链（25 kDa）和诱饵蛋白。

• 裂解缓冲液可兼容 BCA 蛋白定量。

 

III  额外所需的主要试剂和仪器

• 自备试剂：诱饵蛋白的 ChIP 级别抗体、Normal IgG 、PBS 、 甲醛、甘氨酸、无水乙醇、 80%乙醇、苯酚、氯 仿、异戊醇、ddH2O。

• 所需仪器：混匀仪、超声破碎仪、低温离心机。

 

IV  操作流程

*注意：

• 请在吸取树脂前，将移液枪枪头尖部剪掉 1~2mm。

• 为保证树脂均匀分布， 请通过反复颠倒、轻微涡旋彻底混匀瓶中树脂。

• 具体样品量和孵育时间依赖于每个特定体系，可能需要优化才能得到最大产量。

 

4.1  细胞交联

(1)  每组取 2 × 107 个细胞，预冷的 1×PBS 漂洗 2~3 次，彻底去除培养基成分，4°C 1000 g 离心 5 min 收集沉 淀。

(2)  加入 10 mL 1 ×PBS（含 270 µL 37%甲醛，甲醛终浓度为 1%）重悬细胞，放混匀仪上室温交联 10 min。

(3)  加入 1 mL 1.375 M 甘氨酸， 放混匀仪上室温孵育 5 min ，之后将样品置于冰上。

(4)  4 ℃ 1000 g 离心 5 min 收集细胞，弃上清。

(5)  加 10 mL 预冷的 1×PBS 漂洗细胞 2~3 次，彻底去除交联剂成分，4°C 1000 g 离心 5 min 收集细胞沉淀，液 氮速冻 3 min ，- 80 ℃保存。

 

4.2  细胞裂解及染色质超声打断

(1)  向细胞中加入 300 μL ②裂解缓冲液、3 μL ⑦蛋白酶抑制剂（按 1:100 添加），吹打混匀。

(2)  非接触式全自动超声波破碎仪， 高功率，30 s +30 s 冰上超声 28 轮，或接触式超声仪 35%功率，2 s+5 s 冰 上超声破碎细胞 15 min。

(3)  4℃ 13000 g 离心 10 min ，取上清至新的离心管中；取 30 µL 样本作为 input，剩余用于 ChIP 实验，- 80 ℃ 保存。

(4)  取 5 µL DNA 解交联（见步骤4.5），并进行电泳检测片段大小，打断的 DNA 通常在 100-1000 bp 中间，  ChIP-Seq 要求 DNA 片段最好在 100-500 bp 之间，ChIP-qPCR 要求 DNA 片段最好在 300~1000 bp 之间。

* 注意：

i.  如果样本中诱饵蛋白丰度较低，或诱饵蛋白与待测 DNA 结合较弱，也可以增加初始样本量，当样本增加时，裂 解液缓冲液和抑制剂可等比例增加。 300 μL 为最小孵育体积， 但总孵育体积最大不超过离心管体积的 2/3。

ii. 超声过程需保持低温以防染色质过热变性，超声条件因细胞类型和超声设备而异，以上仅为参考，使用时请务 必提前摸索好合适的超声打断条件使 DNA 片段大小在合适范围，若片段偏大需再次进行超声。

 

4.3  漂洗液准备

取出 ⑩10 mL 离心管（空管），加入本次实验 2 组样本（实验组+对照组）所需的 4 mL ③漂洗液和 20 μL ⑦蛋 白酶抑制剂（按 1:200 添加），混合均匀， 冰上保存，现配现用。

* 注意：如果有多组样本， 按照实际使用量配置。

 

4.4  染色质免疫共沉淀（ChIP）

(1)  向样本裂解液（4.2 制备） 中加入适量抗体（按照抗体说明书添加），放混匀仪上室温孵育 1~2 h 或 4 ℃过 夜。

(2)  每组实验取 40 μL ①树脂，加入 200 µL 漂洗液（4.3 配置） ，颠倒混匀 30 次，500 g 离心 5 min ，弃上清。

(3)  再次加入 200 µL 漂洗液（4.3 配置） ，颠倒混匀 30 次，500 g 离心 5 min ，弃上清，保留树脂。

(4)  向树脂中加入步骤（1）的样本/抗体混合物，放混匀仪上 4 ℃孵育 2 h。

(5)  4 ℃ 500 g 离心 5 min ，弃上清。

(6)  加入 500 μL 漂洗液（4.3 配置），颠倒混匀 30 次，4 ℃ 500 g 离心 5 min，弃上清；重复该漂洗操作 1 次。

(7)  再次加入 500 μL 漂洗液（4.3 配置） ，颠倒混匀 30 次，之后取 100 μL 移入新的离心管中用于蛋白检测（标 注为管 1），剩余 400 μL 用于 DNA 提取（标注为管 2）；两管分别 4 ℃ 500 g 离心 5 min，弃上清。

(8)  向管 1 中加入 20 μL 2×上样缓冲液（125 mM Tris-HCl ，pH 6.8 ，4% SDS ，20%甘油， 0.004%溴酚蓝） 并煮 沸 3 min ，12000 g 离心 30 s，收集上清至新的离心管中，用于诱饵蛋白的 Western-Blot 检测。

(9)  向管 2 中加入 40 μL ④洗脱缓冲液，涡旋震荡 20s ，放混匀仪上室温洗脱 10 min，涡旋震荡 20s；4 ℃ ,12000 g 离心 5 min ，收集上清至新的离心管中。

 

4.5  解交联

(1)  Input 组、IP 组样品分别加入 356.4 µLddH2O 、3.6µL ⑤10x TE 缓冲液， 65℃孵育 6 h 或者过夜。

(2)  每管加入 8 µL⑧RNase A，颠倒混匀 10~15 次，37 ℃孵育 0.5~2 h。

(3)  每管加入 8 µL ⑨ Proteinase K ，55℃孵育 2 h。

 

4.6  沉淀 DNA

(1)  每管加入 400 µL 苯酚：氯仿：异戊醇混合液（25:24:1），颠倒混匀 10~15 次，室温 13000 g 离心 10 min， 转移上层水相到新的离心管中。

(2)  每管加入 20 µL 5 M ⑥NaCl 和 1 mL 无水乙醇，-20 ℃沉淀 2 h 或过夜，4 ℃ 16000 g 离心 30 min，去上 清。

(3)  加入 500 µL 80%乙醇洗涤沉淀，4 ℃ 16000 g 离心 30 min ，去上清， 开盖晾干乙醇。

(4)  加入 20 µL ddH2O，溶解沉淀 DNA。

 

注意事项：

1.本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

2.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

 

本产品在文章中的写法：

英文： Dowobio （Shanghai，China）

中文： 上海多沃生物科技有限公司  Dowobio，上海