人外周血向巨噬细胞的极化

实验方案（仅参考）

1.从外周血中分离PBMCs，可使用人淋巴细胞分离液进行此步;

2.从PBMCs中分离单核细胞，可使用CD14单核细胞磁珠分选试剂盒进行此步;

3.调整单核细胞浓度为1-2x10^6/ml(可参考文献)，在完全培养基中添加M-CSF(25ng/ml)诱导单核细胞向巨噬细胞的成熟;

4.5天左右分化成熟为巨噬细胞(贴壁)，可选择CD68 表达作为鉴定巨噬细胞成熟的标志蛋白;

5.将成熟的巨噬细胞消化下来，重新铺板，诱导向M1、M2的极化:

M1极化因子:LPS(50ng/ml)IFN-Y(20ng/ml)

M2极化因子:IL-4(20ng/ml)IL-10(20ng/ml)

6.以上两种极化方式刺激因子的浓度参考自以下文献。刺激24小时后，用流式的方法检测极化后M1、M2标志蛋白的表达。M1巨噬细胞上调表达CD86、MHCI1、CD80、CD274等，M2巨噬细胞上调表达CD206、CD163等;

 

 

小鼠骨髓向巨噬细胞的极化

实验方案（仅参考）

1.6-8周龄小鼠取股骨和胫骨骨髓，裂红后制备为单细胞悬液，

2.调整细胞浓度为2x10^6/ml(可参考文献)，铺板培养，在完全培养基中添加10ng/ml MCSF(或L-929细胞上清)诱导向巨噬细胞的成熟;

3.5-7天左右分化成熟为巨噬细胞(贴壁)，中途可在3天进行培养基更换(或半量换液)，可选择F4/80 CD11b 双阳表达作为鉴定巨噬细胞成熟的标志蛋白;

4.将成熟的巨噬细胞消化下来，重新铺板，诱导向M1、M2的极化:

M1极化因子:LPS(100ng/ml)IFN-Y(50ng/ml)

M2极化因子:IL-4(10ng/ml)IL-10(或IL-13)(10ng/ml)

5.以上两种极化方式刺激因子的浓度参考自以下文献。刺激24小时后，用流式的方法检测极化后M1、M2标志蛋白的表达。M1巨噬细胞上调表达CD86、MHCII、CD11c等，M2巨噬细胞上调表达CD206等;

 

 

 

THP-1细胞向M1，M2的极化

实验方案（仅参考）

1.每孔铺8x10^5个细胞至6孔板中，在THP-1完全培养基中添加PMA(100ng/ml)诱导其向巨噬细胞的成熟;

2.48小时后THP-1细胞成熟为巨噬细胞，从悬浮状态变为贴壁细胞。可选择CD11b表达作为鉴定巨噬细胞成熟的标志蛋白;

3.将成熟的巨噬细胞消化下来，重新铺板，诱导向M1、M2的极化:

M1极化因子:LPS(100ng/ml)IFN-Y(20ng/ml)

M2极化因子:IL-4(20ng/ml)IL-13(20ng/ml)

4.以上两种极化方式刺激因子的浓度参考自以下文献。刺激48小时后，用流式的方法检测极化后M1、M2标志蛋白的表达。M1巨噬细胞上调表达CD86等，M2巨细胞上调表达CD206等;

 

 

RAW264.7向M1，M2的极化

实验方案（仅参考）

相较于THP-1细胞来说，RAW264.7的极化相对来说更简单，可直接添加刺激物向两个不同的方向诱导。

实验方案:

1.添加刺激物诱导RAW264.7向M1、M2的极化:

M1极化因子:LPS(100ng/ml)

M2极化因子:IL-4(20ng/ml)

2. 以上两种极化方式刺激因子的浓度参考自以下文献。刺激24或48小时后，用流式的方法检测极化后M1、M2标志蛋白的表达。M1巨噬细胞上调表达CD86等，M2巨细胞上调表达CD206等;

 

 

 

可选择F4/80 CD11b 双阳表达作为鉴定巨噬细胞成熟的标志蛋白.