产品介绍：

细胞中存在大量蛋白与 RNA 的复合物，它们的相互作用发挥重要的生物学 功能。 Dowobio™ RNA IP Kit 提供 Protein A/G 磁珠，可稳定结合目标抗体；通过与 细胞裂解产物孵育可高效富集目的蛋白及其复合物中的 RNA；通过 RNA 纯化可用于后续研究，如 qRT-PCR 、 RNA-sequencing 等。

 

保存说明：

Dowobio™  RNA  IP (RIP)  Kit, Part I，4℃储存（勿冷冻）

RNA IP (RIP) Kit, Part II，-20℃储存。

 

操作说明：

描    述： Dowobio™ RNA IP (RIP) Kit, 包含 Protein A/G Magnetic Beads, Dowobio™ RNA IP Lysis Buffer, RNA IP Buffer, RNase Inhibitor, 0.1 M DTT, 0.5 M EDTA, DNase I, Proteinase K, 10% SDS, Solution I, Solution II, Solution III, Nuclease -Free Water。

 

 

操作步骤：

 细胞裂解及注意事项

1.   用标准的 RNA IP 裂解 buffer ( Dowobio™ RNA IP Lysis Buffer)并加入蛋白酶抑制剂处理细胞。

2.   至少需要 1 × 107 个细胞用于 RNA IP 实验。如被检测的 RNA 含量较低则需要更多的细胞。

3.  确保样品是新鲜的且无细菌等污染。

4.   制备好的样品(RNA IP Lysates)置于 -80℃保存。

免疫复合物制备

1.   用 Dowobio™ RNA IP Kit 提供的试剂按照下表配制 RNA IP Mix：

试剂名称	体积  (μL)	终浓度
RNA IP Buffer	300	-
0.1 M DTT	10	1 μM
RNase Inhibitor	10	400 U
0.5 M EDTA	30	15 μM
RNA IP Lysates	500 μg	-
Antibody (Test or IgG)	5  μg	-

用 RNA IP Buffer 补足至 1mL

2.  4℃旋转反应 2 小时或过夜。

 

RNA IP

1.  将 Protein A/G  Magnetic Beads 充分混匀，吸取 50  μL 于新的无菌无酶离心管中。

2.  将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

3.   将离心管从磁力架上取出，加入 100 μL RNA IP Buffer (4℃预冷)，重悬磁珠。

4.  将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

5.   重复步骤 2 和 3，2 次。

6.   将离心管从磁力架上取出，   加入 100 μL RNA IP Buffer (4℃预冷)，重悬磁珠。

7.  将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

8.   将离心管从磁力架上取出，加入 1 mL RNA IP Mix ，温和重悬磁珠。

9.  4℃旋转反应 2-4 小时。

10. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

11. 将离心管从磁力架上取出，  加入 500 μL RNA IP Buffer (4℃预冷)，温和混匀。

12. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

13. 重复步骤 11 和 12，3 次。

14. 将离心管从磁力架上取出，  加入 500 μL RNA IP Buffer (4℃预冷)，温和混匀。

15. 将离心管置于磁力架上， 收集磁珠，将上清液转移至新的无菌无酶离心管中，

用于后续分析。

16. 将离心管从磁力架上取出，加入 100 μL RNA  IP Buffer (4℃预冷)于磁珠离心管，再加入 5 μL DNase I (2 U/μL)，温和混匀。

17. 37℃旋转反应 10 分钟。

18. 加入 500 μL RNA IP Buffer，温和混匀。

19. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

20. 将离心管从磁力架上取出，加入 500 μL RNA IP Buffer，温和混匀。

21. 用 Dowobio™ RNA IP Kit 提供的试剂按照下表配制 Proteinase Mix：

试剂名称	体积  (μL)	终浓度
RNA IP Buffer	120	-
Proteinase K	15	150 μg
10% SDS	15	-

150 μL

22. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

23. 将离心管从磁力架上取出，加入 150 μL Proteinase Mix，温和混匀。

24. 55℃旋转反应 20 分钟，或每 5 分钟温和重悬 1 次磁珠。

25. 将离心管置于磁力架上，收集上清液于新的无菌无酶水离心管，并加入  250μL RNA IP Buffer 至每管。

 

RNA Isolation

1.   加入 400 μL 酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)至每管。

2.   涡旋 15 秒，室温 14,000 rmp 离心 10 分钟。

3.  取 350 μL 上清液至新的无菌无酶离心管，并加入 400 μL 氯仿。

4.   涡旋 15 秒，室温 14000 rmp 离心 10 分钟。

5.  取 300 μL 上清液至新的无菌无酶离心管。

6.  分别在每管中加入 50 μL Solution I，15 μL Solution II，2 μL Solution III，以及850 μL 预冷的无水乙醇。

7.  颠倒混匀，置于 -20℃或-80℃至少 1 小时或过夜，以沉淀 RNA。

8.  将离心管 14,000 rpm，4℃离心 30 分钟，弃掉上清液。

9.   加入 80%无水乙醇，  14,000 rpm，4℃离心 15 分钟， 弃掉上清液，   空气干燥。

10. 用 10 - 20 μL Nuclease -free water 溶解 RNA 沉淀， 置于冰上，  或 -80℃保存。

 

注意事项：

1. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

 

本产品在文章中的写法：

 英文： Dowobio （Shanghai，China）

 中文： 上海多沃生物科技有限公司  Dowobio，上海