产品简介：

RNA Pull-down Kit 提供链霉亲和素磁珠与生物素标记的寡核苷酸结合；通过 Waals™ RNA Ligation Kit 提供的试剂将目的RNA 与寡核苷酸连接，进而与样品蛋白孵育形成 RNA-蛋白复合物，通过磁珠分离可高效富集与目的 RNA 相互作用的蛋白。通过 Elution 洗脱后可进行 SDS-PAGE、银染、质谱、免疫印迹等分析。

RNA Ligation Kit 提供T4 RNA 连接酶在特殊反应体系中将目的RNA 与寡核苷酸连接。由于寡核苷酸已与磁珠结合，所以目的 RNA 不会与寡核苷酸混连，几乎不影响 RNA 的结构。试剂盒提供的方法获得的 RNA pull-down 产物可用于后续的银染、质谱、免疫印迹等实验。

 

操作流程:

 

操作步骤：

1. 细胞裂解及注意事项

1. 用标准的蛋白裂解 buffer (e.g., Waals™ IP Lysis Buffer)并加入蛋白酶抑制剂处理细胞。

2. 蛋白的浓度应大于 2mg/mL，以确保在 RNA Pull-down 实验中蛋白量充足。

3. 确保蛋白为新鲜提取蛋白且无细菌等污染。

2. 磁珠准备

1. 重悬磁珠，吸取 50μL 至无酶离心管中。

2. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

3. 用 50μL 20 mM Tris 重悬磁珠。

4. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

5. 重复步骤 3 和 4。

6. 用 50μL 1 × RNA Capture Buffer 重悬磁珠。

3. 磁珠与生物素标记核苷酸反应

1. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

2. 用 50μL 1 × RNA Capture Buffer 重悬磁珠。

3. 加入 1μL Biotinylated Oligonucleotides (50 pmol)，室温旋转孵育 30 分钟。

4. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

5. 加入 100μL 无菌无酶水，重悬磁珠。

6. 重复步骤 4 和 5。

4. RNA 连接

加入 3μL DMSO 于装有 5μL 目的 RNA（~ 50 pmol）的离心管中并混匀，置于 85℃孵育

5 分钟，立即置于冰上冷却，以打开 RNA 二级结构并用于后续实验。

用 RNA Ligation Kit 提供的试剂按照下表配制 RNA Ligation Mix：

试剂名称	体 积 (μL)	终浓度
10 × RNA Ligase Reaction Buffer	3	1 ×
RNase Inhibitor	1	40 U
Control RNA or Test RNA	8	50 pmol
0.1% BSA	2	0.006%
T4 RNA Ligase	1	40 U
30% PEG	15	15%
	30

备注：30% PEG 须最后加入并充分混匀。

 

1. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

2. 将 30 μL RNA Ligation Mix 加入离心管中，温和混匀。

3. 室温旋转反应 2 - 4 小时。

4. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

5. 将 10 × RNA-Protein Binding Buffer 稀 释 为 1 ×， 即 加 入 30μL 10 × RNA-Protein Binding Buffer 至 270μL 无菌无酶水中，混匀。

6. 加入 100μL 1 × RNA-Protein Binding Buffer，温和重悬。

7. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

8. 重复步骤 6 和 7.

9. 加入 100μL 1 × RNA-Protein Binding Buffer 于离心管中，温和重悬。

5. RNA Pull-down

用 Waals™ RNA Pull-down Kit 提供的试剂按下表配制 RNA Pull-down Mix：

试剂名称	体 积 (μL)	终浓度
10 × RNA-Protein Binding Buffer	10	1 ×
50% glycerol	30	-
Lysate (protein conc. >2mg/mL)	20 - 40	> 40 μg
Nuclease-free water	to 100	-
	100

 

1. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

2. 将 100μL RNA Pull-down Mix 加入离心管中，温和重悬。

3. 室温旋转反应 30 - 60 分钟或 4℃旋转反应过夜。

4. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠，将上清液转入新的离心管，可用于后续分析。

5. 加入 100μL 1 × Wash buffer，温和重悬。

6. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠弃掉上清液。

7. 重复步骤 5 和 6，2 次。

8. 加入 100μL 1 × Wash buffer，温和重悬。

9. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠，将上清液转入新的离心管，可用于后续分析， 以评估是否洗净。

10. 加入 50μL Elution buffer 至离心管中，充分混匀。

11. 室温旋转反应 30 - 60 分钟。

12. 将离心管置于磁力架上，收集上清液至新的离心管中，用于后续实验。

 

实验相关问题：

问题	可能原因	解决方案
1. RNA 降 解	有 RNA 酶污染	采用无酶试管，反应中加入 RNA 酶抑制剂，操作中注意避免 RNA 酶污染
2. 非特异性蛋白较多	磁珠非特异性吸附蛋白	加入 0.1 - 0.5 mg/mL BSA 溶液封闭磁 珠非特异性吸附
	洗涤不充分	增加洗涤次数
3. 未检测到目的蛋白	蛋白质降解或污染	确保蛋白质为新鲜提取，未污染的蛋 白质
	蛋白质含量不够	增加蛋白含量
	蛋白抗体问题	增加对照实验检测蛋白抗体是否有 效，且检测灵敏度是否足够
	蛋白裂解不充分或过度	更换合适的蛋白裂解液
	洗脱不充分	可增加 Elution buffer 洗脱时间

 

本产品在文章中的写法：

英文： Dowobio （Shanghai，China）

中文： 上海多沃生物科技有限公司  Dowobio，上海