产品简介：

细胞中存在大量蛋白与 RNA 的复合物，它们的相互作用发挥重要的生物学功能。RNA IP Kit 提供 NHS 磁珠，可稳定结合目标抗体；通过与细胞裂解产物孵育可高效富集目的蛋白及其复合物中的 RNA；通过 RNA 纯化可用于后续研究，如 qRT-PCR、RNA-sequencing 等。

 

操作流程：

 

 

 

 

 

 

操作步骤：

1. 细胞裂解及注意事项

1. 用标准的 RNA IP 裂解 buffer (e.g.,RNA IP Lysis Buffer)并加入蛋白酶抑制剂处理细胞。

2. 至少需要 1 × 107 个细胞用于 RNA IP 实验。如被检测的 RNA 含量较低则需要更多的细胞。

3. 确保样品是新鲜的且无细菌等污染。

4. 制备好的样品(RNA IP Lysates)置于-80℃保存。

2. 磁珠准备

1. 重悬 NHS 磁珠，吸取 50 μL 至无酶离心管中。

2. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

3. 将离心管从磁力架上取出，加入 100 μL RNA IP Buffer，重悬磁珠。

4. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

5. 重复步骤 3 和 4。

6. 将离心管从磁力架上取出，加入 100 μL RNA IP Buffer，重悬磁珠。

3. 磁珠与抗体反应

1. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

2. 将离心管从磁力架上取出，加入 250 μL RNA IP Buffer，重悬磁珠。

3. 加入 5μg 抗体，包括抗目的蛋白的抗体、IgG (对照)，混匀。

4. 4℃孵育过夜。

4. RNA IP

1. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

2. 将离心管从磁力架上取出，加入 500 μL RNA IP Buffer (4℃预冷)，重悬磁珠。

3. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

4. 重复步骤 2 和 3。

5. 将离心管从磁力架上取出，加入 500 μL RNA IP Buffer (4℃预冷)，重悬磁珠。

6. 用RNA IP Kit 提供的试剂按照下表配制 RNA IP Mix：

 

试剂名称	体积 (μL)	终浓度
RNA IP Buffer	300	-
0.1 M DTT	10	1 μM
RNase Inhibitor	10	400 U
0.5 M EDTA	30	15 μM
RNA IP Lysates	500 μg	-
Use RNA IP Buffer up to	1 mL

 

7. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

8. 将离心管从磁力架上取出，加入 1 mL RNA IP Mix，重悬磁珠。

9. 4℃旋转反应 2 小时。

10. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

11. 将离心管从磁力架上取出，加入 500 μL RNA IP Buffer (4℃预冷)，温和混匀。

12. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

13. 重复步骤 11 和 12，3 次。

14. 将离心管从磁力架上取出，加入 500 μL RNA IP Buffer (4℃预冷)，温和混匀。

15. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠，将上清液转移至新的无菌无酶离心管中， 用于后续分析。

16. 将离心管从磁力架上取出，加入 100 μL RNA IP Buffer (4℃预冷)于磁珠离心管，再加入 5 μL DNase I (2 U/μL)，温和混匀。

17. 37℃反应 10 分钟。

18. 加入 500 μL RNA IP Buffer，重悬磁珠。

19. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

20. 将离心管从磁力架上取出，加入 500 μL RNA IP Buffer，重悬磁珠。

21. 用 RNA IP Kit 提供的试剂按照下表配制 Proteinase Mix：

 

试剂名称	体积 (μL)	终浓度
RNA IP Buffer	120	-
Proteinase K	15	150 μg
10% SDS	15	-
	150 μL

 

22. 将离心管置于磁力架上，收集磁珠并弃掉上清液。

23. 将离心管从磁力架上取出，加入 150 μL Proteinase Mix，重悬磁珠。

24. 55℃旋转反应 20 分钟，或每 5 分钟重悬磁珠 1 次。

25. 将离心管置于磁力架上，收集上清液于新的无菌无酶水离心管，并加入 250 μL RNA IP Buffer 至每管。

5. RNA Isolation

1. 加入 400 μL 酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)至每管。

2. 涡旋 15 秒，室温 14,000 rmp 离心 10 分钟。

3. 取 350 μL 上清液至新的无菌无酶离心管，并加入 400 μL 氯仿。

4. 涡旋 15 秒，室温 14000 rmp 离心 10 分钟。

5. 取 300 μL 上清液至新的无菌无酶离心管。

6. 分别在每管中加入 50 μL Solution I，15 μL Solution II，2 μL Solution III，以及 850 μL 预冷的无水乙醇。

7. 颠倒混匀，置于-20℃或-80℃至少 1 小时或过夜，以沉淀 RNA。

8. 将离心管 14,000 rpm，4℃离心 30 分钟，弃掉上清液。

9. 加入 80%无水乙醇，14,000 rpm，4℃离心 15 分钟，弃掉上清液，空气干燥。

10. 用 10 - 20 μL Nuclease-free water 溶解 RNA 沉淀，置于冰上，或-80℃保存。

 

本产品在文章中的写法：

英文： Dowobio （Shanghai，China）

中文： 上海多沃生物科技有限公司  Dowobio，上海