产品简介：

细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细 胞膜外，使 PS 暴露在细胞膜外表面。PS 是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋 亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使 PS 暴露在细胞膜外。Annexin V 具有易于结合到磷脂类如 PS 的特性，对 PS 有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的 PS。PS 转移到 细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是 完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以采用 Annexin V 与 PI 双染的方法，通 过流式检测细胞早期凋亡。

 

操作步骤：

1. 细胞样品的准备：

a)对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用不含EDTA的胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管 或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。 1000rpm左右离心5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或 稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50µl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1ml 4℃预冷的PBS，重悬 细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。

b)对于悬浮细胞：1000rpm左右离心5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适 当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50µl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1ml 4℃ 预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。

2. 用去离子水按1:3稀释结合缓冲液(4ml 4x结合缓冲液+12ml去离子水)；

3. 用1x结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1-5×106 /ml；

4. 取100µl的细胞悬液于5ml流式管中，加入5µl Annexin V/eGFP混匀后于室温避光孵育5分钟；

5. 加入10µl 20ug/ml的碘化丙锭溶液(PI)，并加400µl PBS，立刻进行流式检测。

 

实验设计：

空白管：阴性对照组细胞，不加Annexin V/eGFP，碘化丙锭溶液(PI)，用于调节电压。

单染管1：阳性对照组细胞，只加Annexin V/eGFP，用于调节补偿。

单染管2：阳性对照组细胞，只加碘化丙锭溶液(PI)，用于调节补偿。

检测管：处理的细胞，加 Annexin V/eGFP，碘化丙锭溶液(PI)。用空白管和单染管调节好电压补偿后，获得所需要 的流式数据。

 

检测波长：

GFP激发波长是488nm,发射波长是507nm,PI激发波长是488nm 发射光波波长大于630nm。

 

注意事项：

1. 不能用含有EDTA的胰酶消化

2. 本试剂盒需使用流式细胞仪进行检测。

3. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

 

本产品在文章中的写法：

英文： Dowobio （Shanghai，China）

中文： 上海多沃生物科技有限公司  Dowobio，上海