产品简介：

细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转 移到细胞膜外，使 PS 暴露在细胞膜外表面。PS 是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜 的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使 PS 暴露在细胞膜外。 Annexin V 具有易于结合到磷脂类如 PS 的特性，对 PS 有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏 感的探针检测暴露在细胞膜表面的 PS。PS 转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。 两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整 性就破坏了。因此，可以采用 AnnexinV 与7-AAD 双染的方法，通过流式检测细胞早期凋亡。

 

操作步骤：

1、细胞样品的准备：

a)对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用不含 EDTA 的胰酶消化细胞，至细 胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细 胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。1000rpm 左右离心 5min，沉淀细胞。对于特定的 细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍加大离心力。小心吸除 上清，可以残留约 50μl 左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约 1ml 4°C 预冷的 PBS，重悬细 胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。

b)对于悬浮细胞：1000rpm 左右离心 5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法完全离 心至离心管底，可以适当延长离心时间或稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约 50μl 左右 的培养液，以避免吸走细胞。加入约 1ml 4°C 预冷的 PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心 吸除上清。

2、 用去离子水按 1:9 稀释结合缓冲液（2 ml 10×结合缓冲液+18ml 去离子水）。

3、 用 1×结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为 1-5×10 6 /ml。

4、 取 100μl 的细胞悬液于 5ml 流式管中，加入 5μl Annexin V/Alexa Fluor 647 混匀后于室温避光孵 育 5 分钟。

5、 加入 5μl 20μg/ml 的碘化丙啶溶液（PI），并加 400μlPBS，立刻进行流式检测。

 

实验设计：

1)未转染细胞

空白管：阴性对照组细胞，不加 Annexin V/Alexa Fluor647，7-AAD。用于调节电压。

检测管：处理的细胞，加 Annexin V/Alexa Fluor 647，7-AAD。用空白管和单染管调 节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。

注：无需单染管 Annexin V/Alexa Fluor 647 调补偿。

2)转染 GFP 细胞

未转染空白管：未转染细胞，不加 Annexin V/Alexa Fluor647，7-AAD。用于调电压。

转染 GFP 空白管：转染 GFP 对照组细胞，不加 Annexin V/Alexa Fluor 647，7-AAD。 用于调补偿。

检测管：处理的细胞，加 Annexin V/Alexa Fluor 647，7-AAD。调节好电压补偿后， 获得所需要的流式数据。

Annexin V/Alexa Fluor647激发和发射波长为 650/668 nm，7-AAD-DNA复合物的最大激发波长是546nm，最大发射波长为647nm。

 

注意事项：

1. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

 

本产品在文章中的写法：

英文： Dowobio （Shanghai，China）

中文： 上海多沃生物科技有限公司  Dowobio，上海