产品简介：

 细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细 胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡 时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的 特性，对PS有高度的亲和性。因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外 不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的， 而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此，可以采用Annexin V与7-AAD双染的方法，通过流式检 测细胞早期凋亡。

 

操作步骤：

1. 细胞样品的准备：

a)对于贴壁细胞：小心收集细胞培养液到一离心管内备用。用不含EDTA的胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管 或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。 1000rpm左右离心5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适当延长离心时间或 稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50µl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1ml 4℃预冷的PBS，重悬 细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。

b)对于悬浮细胞：1000rpm左右离心5min，沉淀细胞。对于特定的细胞，如果细胞无法完全离心至离心管底，可以适 当延长离心时间或稍稍加大离心力。小心吸除上清，可以残留约50µl左右的培养液，以避免吸走细胞。加入约1ml 4℃ 预冷的PBS，重悬细胞，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清。

2. 用去离子水按1:3稀释结合缓冲液(4ml 4x结合缓冲液+12ml去离子水)；

3. 用1x结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1-5×106 /ml；

4. 取100µl的细胞悬液于5ml流式管中，加入5µl Annexin V/FITC混匀后于室温避光孵育5分钟；

5. 加入10µl 20ug/ml的7-AAD，并加400µl PBS，立刻进行流式检测。

 

实验设计：

空白管：阴性对照组细胞，不加Annexin V/FITC和7-AAD，用于调节电压。

单染管1：阳性对照组细胞，只加Annexin V/FITC，用于调节补偿。

单染管2：阳性对照组细胞，只加7-AAD，用于调节补偿。

检测管：处理的细胞，加 Annexin V/FITC，7-AAD。用空白管和单染管调节好电压补偿后，获得所需要的流式数据。

 

样本分析：

1 流式细胞仪分析：FITC 的最大激发波长是 488nm，最大发射波长是 525nm，建议选择 FL1 通道检测；7-AAD-DNA 复合物的最大激发波长是 546nm，最大发射波长为 647nm，7-AAD 的红色荧光在 FL3 通道检测。用 FlowJo 等软件 进行分析，绘制双色散点图（two-color dot plot），FITC 为横坐标，7-AAD 为纵坐标。典型的实验中，细胞可以 分成三个亚群，活细胞仅有很低强度的背景荧光，早期凋亡细胞仅有较强的绿色荧光，晚期凋亡或坏死的细胞有 绿色和红色荧光双重染色。

2 荧光显微镜观察：

a)滴一滴用 Annexin V-FITC/7-AAD 双染的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞。

b)在荧光显微镜下用双色滤光片观察。Annexin V-FITC 荧光信号呈绿色，7-AAD 荧光信号呈红色。

【注】：对于贴壁细胞，可直接用盖玻片培养细胞并诱导细胞凋亡。

 

注意事项：

1. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

 

本产品在文章中的写法：

英文： Dowobio （Shanghai，China）

中文： 上海多沃生物科技有限公司  Dowobio，上海