产品介绍：

活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一种基于荧光染料DCFH-DA (2,7-Dichlorodi -hydrofluorescein diacetate)的荧光强度变化，定量检测细胞内活性氧水平的最常用方法。

DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜。进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH，而DCFH不会通透细胞膜，因此探针很容易被积聚在细胞内。细胞内的活性氧能够氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。绿色荧光强度与活性氧的水平成正比。在最大激发波长480 nm，最大发射波长525 nm处，使用荧光显微镜、流式细胞仪或激光共聚焦显微镜等检测荧光信号。Rosup为活性氧阳性诱导药物，根据其荧光信号强度，可分析活性氧的真正水平。

以96孔板每孔加样量为标准，本试剂盒可测定约1000次。

 

操作过程

1. 装载探针

1.1原位装载探针（仅适用于贴壁细胞）

1.1.1细胞准备：检测前一天进行细胞铺板，确保检测时细胞汇合度达到50~70%。

【注】：必须保证细胞状态健康，且检测时不会过度生长。

1.1.2药物诱导：去除细胞培养液，加入适量经合适的缓冲液或无血清培养基稀释到工作浓度的药物，于37℃细胞培养箱内避光孵育，具体诱导时间根据药物本身特性，以及细胞类型来决定。

（可选）阳性对照：先用无血清培养基等稀释阳性对照(Rosup, 100 mM)到常用工作浓度100 μM，加入细胞，一般37℃避光孵育30 min-4 h可显著看到活性氧水平提高，但依细胞类型会有比较明显差异。【如HeLa细胞孵育30 min；MRC5人胚胎成纤维细胞1.5 h】

1.1.3探针准备：探针装载前按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10 μM。

1.1.4探针装载：吸除诱导用药物，加入适当体积稀释好的DCFH-DA工作液。加入的体积以能充分盖住细胞为宜。例如，对于6孔板通常不少于1000 μL，对于96孔板通常不少于100 μL。37℃细胞培养箱内避光孵育30 min。

1.1.5细胞清洗：用无血清培养液洗涤细胞1~2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

1.2 收集细胞后装载探针：适用于贴壁细胞和悬浮细胞。

1.2.1细胞准备：按照标准方法培养细胞，必须保证检测用细胞状态健康。按照适当方法，清洗并收集足量的细胞。

1.2.2药物诱导：将收集好的细胞悬浮于适量稀释好的药物，于37℃细胞培养箱内避光孵育，具体诱导时间根据药物本身特性，以及细胞类型来决定。

（可选）阳性对照：先用无血清培养基等稀释阳性对照(Rosup, 100 mM)到常用工作浓度100 μM，加入细胞，一般37℃避光孵育30 min-4 h可显著看到活性氧水平提高，但依细胞类型会有比较明显差异。【如HeLa细胞孵育30 min；MRC5人胚胎成纤维细胞1.5 h】

1.2.3探针准备：探针装载前，按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10 μM。

1.2.4探针装载：去除细胞内药物，离心收集细胞，加入适当稀释好的探针，使其细胞密度为1.0×106~2.0×107。【注】：细胞密度需根据后续的检测体系，检测方法，以及检测总量来进行调整。如对于流式分析，单管检测内细胞数目不少于104，也不可多于106。每隔3-5 min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。

1.2.5细胞清洗：用无血清细胞培养液洗涤细胞1~2次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

2. 检测

2.1原位装载探针法：激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。

2.2收集细胞后装载探针：用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，也可以用激光共聚焦显微镜直接观察。

3. 参数设置

使用488 nm激发波长，525 nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。

 

其他事项说明

1. 对于刺激时间较短（通常2 h以内）的细胞，也可先装载探针，后用活性氧阳性对照和/或感兴趣药物刺激细胞，如阳性对照刺激，应先加入适量探针于37℃避光孵育30 min；然后再加入等体积2×阳性对照Rosup溶液(200 μM)，37℃避光诱导30 min-4 h；

2. 阳性对照Rosup通常浓度为100 μM。通常刺激后30 min-4 h可以观察到显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30 min内观察不到活性氧的升高，可延长诱导时间或适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可缩短诱导时间或适当降低活性氧阳性对照的浓度。

3. 对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1: 2000～1: 5000稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA的浓度为2～5 μM。探针装载的时间也可以根据情况在15～60 min内适当进行调整。

4. 活性氧阳性对照(Rosup)仅仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照。

 

注意事项

1. 探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

2. 探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。

3. 尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5. 本产品仅作科研用途！

 

本产品在文章中的写法：

英文： Dowobio （Shanghai，China）

中文： 上海多沃生物科技有限公司  Dowobio，上海