背 景

        我们通常所说的Th1、Th2和Th17是指T辅助细胞（严格意义上是Th0细胞）在各种生理与病理条件下分化为Th1、Th2和Th17的能力。静息状态（即未受任何刺激，如人的正常生理状态）下，Th0分化为Th1、Th2和Th17的能力非常弱，所以外周血中仅含有极少量的Th1、Th2和Th17细胞，这时我们所能检测到的IFN-γ、IL-4、IL-17A也微乎其微。而当Th细胞受到外界因素，如刺激素，病原体等刺激，其中Th0即会向Th1、Th2或Th17大量分化，具体分化趋向取决于细胞因子的种类。此时，我们检测到的IFN-γ、IL-4或IL-17A也较多。实验中我们检测的Th1、Th2和Th17实际上是检测Th细胞对刺激素刺激的反应能力。
 
我们通常选用的刺激素为PMA(佛波酯)+ Ionomycin(离子霉素)。
 
        其中PMA为PKC（蛋白激酶C）的激活物，PKC则可激活下游众多的蛋白激酶的磷酸化，形成级联反应，导致许多蛋白的表达，进而引起T细胞的活化。在细胞内，PKC可被DAG（二脂酰甘油）和Ca²⁺的共同作用而激活，因此在Ionomycin（Ca²⁺的转运剂，可将细胞器内的Ca²⁺转运至胞浆内）的参与下，T细胞内PKC可被进一步激活。可见，PMA与Ionomycin协同活化T细胞。
也有人选用其它刺激剂来活化T细胞，如CD3/CD28协同刺激，PHA刺激等。实验表明，PMA为广谱性刺激，即T细胞中的各亚群均会被PMA同等激活，而CD3/CD28协同刺激和PHA刺激，则是通过TCR受体的作用，仅对部分T细胞亚群有效。所以可根据实验的需要来选择刺激方式。
 
        活化的T细胞可分泌多种细胞因子至细胞外，而流式细胞仪仅能检测细胞内的抗原，所以应阻断细胞因子分泌至细胞外。方法为破坏高尔基体（Golgi），因细胞因子（即各种蛋白）在合成后需经高尔基体的加工和转运，才能到达细胞膜，然后通过高尔基体膜与细胞膜的融合作用将细胞因子分泌至细胞外。因此破坏高尔基体即可切断细胞因子的转运途径，干扰其分泌。通常选用的阻断剂为Brefeldin A (BFA, 布雷非德菌素A)和/或Monensin (莫能霉素)。
另外，实验过程中涉及到如何正确的选定Th（即T辅助细胞）的问题。Th细胞的表面标志为CD3+CD4+，而当用PMA刺激4小时时，会发现CD4+的细胞明显减少，甚至消失，这是因为PMA会诱发细胞表面CD4分子被内吞。所以通常的做法是用CD3和CD8反设CD4细胞，即CD3+CD8-的细胞被认为是CD3+CD4+的细胞。（注：PMA对小鼠CD4的影响很小，所以检测小鼠Th1/Th2/Th17时可用CD4直接设门）。
 
        抗凝剂的选择也非常重要。使用肝素钠和肝素锂作为抗凝剂，不影响Th细胞的活化和细胞因子的分泌，而使用EDTA 和枸橼酸钠作为抗凝剂则无法检测到细胞因子。此时，应使用PBMCs而不是抗凝血进行刺激。
 

实 验 步 骤

【 样 本 制 备 】

A. 全血标本

用肝素抗凝管采集静脉血（必须用肝素钠抗凝，不可用肝素锂、EDTA或枸橼酸钠）1-2ml，血液室温或4℃放置，8小时内必须进行检测，否则需弃用。

B. 外周血单个核细胞（PBMC）标本

1) 对于使用其它抗凝剂（如EDTA或枸橼酸钠）抗凝血，采集静脉血至少1ml，采集后4小时内使用；
2)加入等体积的Hank’s液或不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS或生理盐水稀释血液；
3)取1ml淋巴细胞分离液加入离心管中；
4)将稀释血液小心地加到淋巴细胞分层液上，注意保持两者界面清晰；
5)室温下，1500r/min，离心15分钟；
6)用毛细吸管轻轻吸出单个核细胞层，加入含有4-5ml Hank’s液或不含Ca²⁺和Mg²⁺的PBS或生理盐水的试管中，充分混匀；
7)1500r/min，离心10分钟，弃上清后，再洗一次；
8)弃上清，用含10% 胎牛血清的培养基重悬单个核细胞，用台酚兰染色计数活细胞数（应在95％以上）；
9)调节细胞浓度为1x10⁷细胞/ml。
 
【需要的产品】
Human

组分

抗人CD3, FITC (克隆号：OKT3)

抗人CD8α, PerCP-Cy5.5 (克隆号：RPA-T8)

抗人IL-17A, PE (克隆号：(64DEC17)

佛波酯/离子霉素混合物(250×)

布雷非德菌素A/莫能霉素混合物(250×)

固定破膜剂试剂A

固定破膜剂试剂B

流式染色缓冲液(10×)

 
Mouse

组分

抗小鼠CD3ε, FITC (克隆号：145-2C11)

抗小鼠CD4, PerCP- Cy5.5 (克隆号：GK1.5)

抗小鼠IL-17A, PE (克隆号：17B7)

佛波酯/离子霉素混合物(250×)

布雷非德菌素A/莫能霉素混合物(250×)

固定破膜剂试剂A

固定破膜剂试剂B

流式染色缓冲液(10×)

 
【其他可能需要的产品】

 

产品名称

人淋巴细胞分离液

小鼠淋巴细胞分离液

4% 多聚甲醛

 
【预实验检测刺激效果】

1) 全血标本：取125ul抗凝血至流式管中，加入125μl不含血清的培养基稀释到250ul；PBMC标本：用含10% 胎牛血清的培养基重悬单个核细胞，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)；调节细胞浓度为1×10⁷/ml，取250ul；
2) 在标本中加入250×PMA/Ionomycin  1ul，混匀；
3) 37℃，5% CO₂ 培养箱培养4～6 小时，期间注意相隔1~2 小时混匀一次；
4) 取100ul 样本，加入Human CD3（或Mouse CD4）和CD69 PE（用量详见说明书），室温孵育20分钟（全血样本溶血）后，用流式染色缓冲液洗一遍，300g离心5分钟，弃上清，用流式染色缓冲液重悬至500ul，上机检测；
5) CD3+（或CD4+）细胞中，CD69的阳性率应达到90%以上，进行下一步正式实验。
 
【正式实验】

1a. 全血标本：取125μl抗凝血至流式管中，加入125μl不含血清的培养基和1μl PMA/Ionomycin Mixture（250×）和1μl BFA/Monensin Mixture（250×）。取125μl抗凝血和125μl不含血清的培养基，作为对照。混匀，37℃孵育4 - 6小时，每隔1 - 2小时取出震荡混匀。
1b. PBMC标本：用含10% 胎牛血清的培养基重悬单个核细胞，使细胞浓度为1×10⁷/ml。取250μl PBMCs 至流式管中，加入1μl PMA/Ionomycin Mixture (250×)和1μl BFA/Monensin Mixture (250×)。以只含PBMCs 的样本作为对照。混匀，37℃孵育4 - 6 小时，每隔1 - 2 小时取出震荡混匀。
注：PMA/Ionomycin Mixture (250×)和BFA/Monensin Mixture (250×)极易挥发，使用后请及时旋紧管盖。
2. 从样本管和对照管中取100 μl 细胞悬液至新的流式管中，加入5μl Anti-Human CD3, FITC 和5 μl Anti-Human CD8α, PerCP-Cy5.5（或加入5μl Anti-Mouse CD3ε, FITC 和5 μl Anti-Mouse CD4, PerCP-Cy5.5）。震荡混匀，室温避光孵育15 分钟。
3. 每管加入100 μl FIX & PERM Medium A，震荡混匀，室温避光孵育15 分钟。
4. 用蒸馏水将10×Flow Cytometry Staining Buffer稀释为1×，每管加入2 ml预冷1×Flow Cytometry Staining Buffer，300 ×g离心5分钟，弃上清。
注：液体尽量倒干净，不要有残留。
5. 每管加入100 μl FIX & PERM Medium B 和5 μl Anti-Human IL-17A, PE（或5 μl Anti-Mouse IL-17A, PE）。震荡混匀，室温避光孵育15 分钟。
6. 每管加入2 ml 1×Flow Cytometry Staining Buffer，300×g 离心5 分钟，弃上清。
7. 每管加入500μl 1×Flow Cytometry Staining Buffer 重悬，上机检测；或者加入500μl 1-4 %多聚甲醛重悬，2- 8℃避光，于24小时内检测。