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Th17 检测原理和样品检测的方法

2020年06月25日

背 景

        我们通常所说的Th1、Th2和Th17是指T辅助细胞(严格意义上是Th0细胞)在各种生理与病理条件下分化为Th1、Th2和Th17的能力。静息状态(即未受任何刺激,如人的正常生理状态)下,Th0分化为Th1、Th2和Th17的能力非常弱,所以外周血中仅含有极少量的Th1、Th2和Th17细胞,这时我们所能检测到的IFN-γ、IL-4、IL-17A也微乎其微。而当Th细胞受到外界因素,如刺激素,病原体等刺激,其中Th0即会向Th1、Th2或Th17大量分化,具体分化趋向取决于细胞因子的种类。此时,我们检测到的IFN-γ、IL-4或IL-17A也较多。实验中我们检测的Th1、Th2和Th17实际上是检测Th细胞对刺激素刺激的反应能力。
 
我们通常选用的刺激素为PMA(佛波酯)+ Ionomycin(离子霉素)。
 
        其中PMA为PKC(蛋白激酶C)的激活物,PKC则可激活下游众多的蛋白激酶的磷酸化,形成级联反应,导致许多蛋白的表达,进而引起T细胞的活化。在细胞内,PKC可被DAG(二脂酰甘油)和Ca2+的共同作用而激活,因此在Ionomycin(Ca2+的转运剂,可将细胞器内的Ca2+转运至胞浆内)的参与下,T细胞内PKC可被进一步激活。可见,PMA与Ionomycin协同活化T细胞。
也有人选用其它刺激剂来活化T细胞,如CD3/CD28协同刺激,PHA刺激等。实验表明,PMA为广谱性刺激,即T细胞中的各亚群均会被PMA同等激活,而CD3/CD28协同刺激和PHA刺激,则是通过TCR受体的作用,仅对部分T细胞亚群有效。所以可根据实验的需要来选择刺激方式。
 
        活化的T细胞可分泌多种细胞因子至细胞外,而流式细胞仪仅能检测细胞内的抗原,所以应阻断细胞因子分泌至细胞外。方法为破坏高尔基体(Golgi),因细胞因子(即各种蛋白)在合成后需经高尔基体的加工和转运,才能到达细胞膜,然后通过高尔基体膜与细胞膜的融合作用将细胞因子分泌至细胞外。因此破坏高尔基体即可切断细胞因子的转运途径,干扰其分泌。通常选用的阻断剂为Brefeldin A (BFA, 布雷非德菌素A)和/或Monensin (莫能霉素)。
另外,实验过程中涉及到如何正确的选定Th(即T辅助细胞)的问题。Th细胞的表面标志为CD3+CD4+,而当用PMA刺激4小时时,会发现CD4+的细胞明显减少,甚至消失,这是因为PMA会诱发细胞表面CD4分子被内吞。所以通常的做法是用CD3和CD8反设CD4细胞,即CD3+CD8-的细胞被认为是CD3+CD4+的细胞。(注:PMA对小鼠CD4的影响很小,所以检测小鼠Th1/Th2/Th17时可用CD4直接设门)。
 
        抗凝剂的选择也非常重要。使用肝素钠和肝素锂作为抗凝剂,不影响Th细胞的活化和细胞因子的分泌,而使用EDTA 和枸橼酸钠作为抗凝剂则无法检测到细胞因子。此时,应使用PBMCs而不是抗凝血进行刺激。
 

实 验 步 骤

【 样 本 制 备 】

A. 全血标本

用肝素抗凝管采集静脉血(必须用肝素钠抗凝,不可用肝素锂、EDTA或枸橼酸钠)1-2ml,血液室温或4℃放置,8小时内必须进行检测,否则需弃用。

B. 外周血单个核细胞(PBMC)标本

1) 对于使用其它抗凝剂(如EDTA或枸橼酸钠)抗凝血,采集静脉血至少1ml,采集后4小时内使用;
2)加入等体积的Hank’s液或不含Ca2+和Mg2+的PBS或生理盐水稀释血液;
3)取1ml淋巴细胞分离液加入离心管中;
4)将稀释血液小心地加到淋巴细胞分层液上,注意保持两者界面清晰;
5)室温下,1500r/min,离心15分钟;
6)用毛细吸管轻轻吸出单个核细胞层,加入含有4-5ml Hank’s液或不含Ca2+和Mg2+的PBS或生理盐水的试管中,充分混匀;
7)1500r/min,离心10分钟,弃上清后,再洗一次;
8)弃上清,用含10% 胎牛血清的培养基重悬单个核细胞,用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上);
9)调节细胞浓度为1x107细胞/ml。
 
【需要的产品】
Human

组分

抗人CD3, FITC (克隆号:OKT3)

抗人CD8α, PerCP-Cy5.5 (克隆号:RPA-T8)

抗人IL-17A, PE (克隆号:(64DEC17)

佛波酯/离子霉素混合物(250×)

布雷非德菌素A/莫能霉素混合物(250×)

固定破膜剂试剂A

固定破膜剂试剂B

流式染色缓冲液(10×)

 
Mouse

组分

抗小鼠CD3ε, FITC (克隆号:145-2C11)

抗小鼠CD4, PerCP- Cy5.5 (克隆号:GK1.5)

抗小鼠IL-17A, PE (克隆号:17B7)

佛波酯/离子霉素混合物(250×)

布雷非德菌素A/莫能霉素混合物(250×)

固定破膜剂试剂A

固定破膜剂试剂B

流式染色缓冲液(10×)

 
【其他可能需要的产品】

 

产品名称

人淋巴细胞分离液

小鼠淋巴细胞分离液

4% 多聚甲醛

 
【预实验检测刺激效果】


1) 全血标本:取125ul抗凝血至流式管中,加入125μl不含血清的培养基稀释到250ul;PBMC标本:用含10% 胎牛血清的培养基重悬单个核细胞,用台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上);调节细胞浓度为1×107/ml,取250ul;
2) 在标本中加入250×PMA/Ionomycin  1ul,混匀;
3) 37℃,5% CO2 培养箱培养4~6 小时,期间注意相隔1~2 小时混匀一次;
4) 取100ul 样本,加入Human CD3(或Mouse CD4)和CD69 PE(用量详见说明书),室温孵育20分钟(全血样本溶血)后,用流式染色缓冲液洗一遍,300g离心5分钟,弃上清,用流式染色缓冲液重悬至500ul,上机检测;
5) CD3+(或CD4+)细胞中,CD69的阳性率应达到90%以上,进行下一步正式实验。
 
【正式实验】


1a. 全血标本:取125μl抗凝血至流式管中,加入125μl不含血清的培养基和1μl PMA/Ionomycin Mixture(250×)和1μl BFA/Monensin Mixture(250×)。取125μl抗凝血和125μl不含血清的培养基,作为对照。混匀,37℃孵育4 - 6小时,每隔1 - 2小时取出震荡混匀。
1b. PBMC标本:用含10% 胎牛血清的培养基重悬单个核细胞,使细胞浓度为1×107/ml。取250μl PBMCs 至流式管中,加入1μl PMA/Ionomycin Mixture (250×)和1μl BFA/Monensin Mixture (250×)。以只含PBMCs 的样本作为对照。混匀,37℃孵育4 - 6 小时,每隔1 - 2 小时取出震荡混匀。
注:PMA/Ionomycin Mixture (250×)和BFA/Monensin Mixture (250×)极易挥发,使用后请及时旋紧管盖。
2. 从样本管和对照管中取100 μl 细胞悬液至新的流式管中,加入5μl Anti-Human CD3, FITC 和5 μl Anti-Human CD8α, PerCP-Cy5.5(或加入5μl Anti-Mouse CD3ε, FITC 和5 μl Anti-Mouse CD4, PerCP-Cy5.5)。震荡混匀,室温避光孵育15 分钟。
3. 每管加入100 μl FIX & PERM Medium A,震荡混匀,室温避光孵育15 分钟。
4. 用蒸馏水将10×Flow Cytometry Staining Buffer稀释为1×,每管加入2 ml预冷1×Flow Cytometry Staining Buffer,300 ×g离心5分钟,弃上清。
注:液体尽量倒干净,不要有残留。
5. 每管加入100 μl FIX & PERM Medium B 和5 μl Anti-Human IL-17A, PE(或5 μl Anti-Mouse IL-17A, PE)。震荡混匀,室温避光孵育15 分钟。
6. 每管加入2 ml 1×Flow Cytometry Staining Buffer,300×g 离心5 分钟,弃上清。
7. 每管加入500μl 1×Flow Cytometry Staining Buffer 重悬,上机检测;或者加入500μl 1-4 %多聚甲醛重悬,2- 8℃避光,于24小时内检测。
 

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