一、实验材料

 1. 样品 ：细胞或者冰冻切片

2. 试剂： 4%多聚甲醛或者丙酮；PBS；Triton-100 ；山羊血清；DAPI 染液；抗荧光淬灭封片液；一抗；荧光二抗。

 3. 仪器、耗材：玻片

 二、实验步骤

细胞爬片/冰冻切片免疫荧光实验步骤

1. 在爬片/冰冻切片用PBS 浸洗3 次，每次3 min；

2. 用4% 的多聚甲醛（冰丙酮）固定片15 min，PBS 浸洗玻片3 次，每次3 min；

3. 0.5%Triton X-100( PBS 配制) 室温通透 20 min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；

4. PBS 浸洗玻片3 次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30 min；5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；

6. 加荧光二抗：PBS 浸洗片3 次，每次3 min，吸水纸吸干片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1 h，PBS浸洗切片3 次，每次3 min；

注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。

7. 复染核：滴加DAPI 避光孵育5 min，对标本进行染核，PBS   5 min×4 次洗去多余的DAPI；

8. 用吸水纸吸干片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。